Analisa Protein dengan Metode Bradford

Salah satu prosedur analisa kandungan protein dalam larutan adalah menggunakan metode Bradford yang pertama kali dideskripsikan oleh Bradford (Bradford et al., 1976). Metode ini lebih simple, lebih cepat dan lebih sensitif dibanding metode Lowry, selain itu Bradford juga lebih tahan terhadap interferensi senyawaan nonprotein. Metode Bradford didasarkan pada pengikatan zat warna Coomassie Blue G-250 ke protein, dimana zat warna ini memiliki empat formasi ion berbeda dengan nilai pKa 1.15, 1.82 dan 12.4. Bentuk kationik zat warna ini berwarna merah dan hijau dengan panjang gelombang serapan (absorbansi) maksimum pada 470 dan 650 nm. Sedangkan bentuk anioniknya berwarna biru dengan absorbansi maksimum 590 nm. Pengukuran proteinnya sendiri dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna dalam bentuk anionik (biru), dan biasanya hal ini dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm.

Zat warna Coomassie Blue G-250 bereaksi cepat dengan residu arginil dan lysil dari protein, sehingga hal ini menyebabkan adanya variasi hasil pengukuran untuk jenis protein yang berbeda-beda. Protein dengan residu arginil dan lysil yang lebih banyak tentu akan menghasilkan warna biru yang lebih intens dibanding protein yang residu arginil dan lysilnya lebih sedikit meskipun jumlah proteinnya sama. Namun secara umum metode Bradford masih merupakan metode yang paling sesuai dan paling umum digunakan.

Ada dua jenis assay protein dengan metode Bradford, yaitu Standard Assay –cocok untuk pengukuran kadar protein antara 10 sampai 100 µg– dan Microassay yang dapat mendeteksi antara 1 sampai 10 µg protein. Konsekuensinya microassay lebih rentan terhadap interferensi senyawaan nonprotein.

·         Material yang digunakan

Ø   Pereaksi (Reagent)
Pereaksi yang digunakan dibuat dengan melarutkan 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml asam fosfat 85% dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Pereaksi ini harus difilter dengan kertas saring Whatman no. 1 dan disimpan dalam botol amber (gelap) di suhu ruang. Pereaksi ini stabil hingga beberapa minggu, namun jika terbentuk endapan ketika penyimpanan, maka harus difilter lagi saat hendak digunakan.

Ø   Standar Protein
Bovine γ-globulin dengan konsentrasi 1 mg/ml (atau 100 µg/ml untuk microassay) digunakan sebagai larutan stok (disimpan beku pada suhu -20oC). Konsentrasi protein larutan standard harus diukur sebelum digunakan dengan mengukur absorbansinya pada 280 nm. Absorbansi larutan Bovine γ-globulin 1mg/ml pada cuvet 1 cm adalah 1.35. Jika yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) atau Ovalbumin, maka absorbansinya masing-masing adalah 0.66 dan 0.75.

Ø   Alat Gelas dan Plastik
Alat gelas dan plastik yang digunakan harus benar-benar bersih dan bebas detergen. Jangan menggunakan cuvet silika (Quartz) untuk pengukuran spektrofotometer karena zat pewarna dapat terikat pada bahan ini.

Standard Assay

·         Pipet 100 µl sample yang mengandung kira-kira 10 – 100 µg protein. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara duplo.

·         Untuk kurva kalibrasi, buatlah seri larutan standard 100, 200, 400, 600, 800 dan 1000 µg/ml. Lalu pipet masing-masing 100 µl ke dalam tabung. Siapkan blanko dengan aquadest 100 µl.

·         Tambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung sample dan standard, campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit.

·         Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm.

Catatan:

• Standard 100 µg akan memberikan absorbansi sekitar 0.4.
• Kurva standard-nya tidak linear, dan presisi absorbansinya bervariasi bergantung pada lamanya inkubasi. Jadi kurva kalibrasi harus dibuat untuk setiap assay.

Microassay

·         Pipet 100 µl sample yang mengandung kira-kira 1 – 10 µg protein ke dalam tabung Eppendorf 1.5 ml. Jika perkiraan konsentrasi proteinnya tidak diketahui, maka bisa dibuat beberapa seri pengenceran (1, 1:10, 1:100, 1:1000, dst). Siapkan secara duplo.

·         Untuk kurva kalibrasi, buatlah seri larutan standard 10, 20, 40, 60, 80 dan 100 µg/ml. Lalu pipet masing-masing 100 µl ke dalam tabung. Siapkan blanko dengan aquadest 100 µl.

·         Tambahkan 1 ml pereaksi Bradford ke dalam masing-masing tabung, campur dengan membolak-balik tabung atau divortex secara perlahan. Hindari terbentuknya busa karena akan mengurangi reproducibility-nya. Inkubasi selama 2 sampai 60 menit.

·         Ukur absorbansi sample dan standard pada panjang gelombang 595 nm. Nilai absorbansi untuk sampel yang mengandung 10 µg γ-globulin adalah 0.45.